Práctica 9: Pruebas de identificación de cocos gram negativos

Pruebas de identificación de cocos gram negativos

Objetivo

El objetivo de estas pruebas es conseguir identificar que microorganismos son cocos gram negativos 

Fundamento
Utilizaremos distintos medios de cultivos y distintas técnicas para proceder a la identificación de los microorganismos

Materiales

• Asas de siembra desechables

• Mechero bunsen

• Portaobjetos

• Pipetas pasteur

• Papel de filtro 

• Pinzas

• Tubo de hemólisis de 3 mL

• Micropipeta automática 

• Tubos de ensayo de vidrio

• Campanas de Durham de  vidrio

Muestra

• Pseudomonas

• E.Coli

• Klebsiella

Reactivo

• Caldo base al rojo fenol

• Suero de Kovacs

• Suero salino fisiológico

• Discos ONPG

Aparataje

• Estufa 

Procedimiento

- Prueba de la oxidasa

Buscamos que tenga la capacidad de producir el enzima "citocromo oxidasa" que cataliza, en la cadena respiratoria, la trandferencia de electrones desde un sustrato orgánico hasta el oxígeno.
Su producción se pone de manifiesto con el reactivo de Kovacs que se oxida en presencia del enzima transformándose en un producto coloreado. 
Se utiliza para diferenciar Pseudomonas (oxidasa +) de Enterobacterias (oxidasa -)

Técnica:

1. Colocamos un trozo de papel de filtro en un portaobjetos
2. Agregamos 2-3 gotas del reactivo de Kovacks en el centro del papel
3. Con un asa de siembra estéril cogemos de la colonia de Pseudomonas y la extendemos sobre el papel impregnado
4. A los 10-15 segundos podemos observar la aparición de color violeta, lo que significa que es una reacción positiva

- Prueba de la fermentación de azúcares

Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas, con frecuencia, fermentan los carbohidratos produciendo ácidos orgánicos y gas que se detectan mediante un indicador de pH y una campana de Durham.

Para diferencias las especies se puede utilizar diferentes azúcares como sustrato

Técnica:

1. Preparamos el caldo base de rojo fenol con: 100 mL de agua destilada y 1,5 gramos de caldo preparado y añadimos 0,2 gramos de glucosa con 10 mL de agua ( glucosa al 2%) y al final lo mezclamos todo y podemos observar que es de color rojo
2. En un tubo de vidrio añadimos 5 mL del caldo preparado
3. Metemos la campana de Durham dentro del tubo y procuramos que no se forme ninguna burbuja de aire dentro
4. Con un asa de siembra estéril cogemos una colonia de la placa de Klebsiella y la inoculamos en el tubo
5. Cerramos el tubo y lo introducimos en la estufa a 37ºC durante 24 horas
6. Al cabo de 24 horas podemos observar que ha virado de rojo a amarillo, así que produce ácido; pero no produce gas dentro de la campana de durham. Finalmente podemos deducir que fermentan carbohidratos

- Prueba de la beta galactosa (ONPG)
Determina la capacidad de algunas bacterias, que poseen el enzima beta-galactosidasa, para fermentar la lactosa originando glucosa y galactosa.
Para realizar la prueba se añade un sustrato artificial, ONPG, que al ser hidrolizado por la beta-galactosidasa origina un compuesto de color amarillo.
Se utiliza para diferenciar a Neisseria lactámica de otras especies de Neisseria.
Diferenciar Enterobacterias: 
- Es positivo en: E.Coli, Klebsiella, Aerobacter y Enterobacter.
- Es negativo en: Proteus, Salmonella, Shigella y Pseudomonas.

- Técnica:

1. En un tubo de ensayo añadimos 1 mL de suero salino fisiológico
2. Flameamos las pinzas y cogemos un disco de ONPG y lo añadimos en el tubo
3. Con un asa de siembra estéril cogemos una colonia de E.Coli y la inoculamos en el tubo
4. Cerramos el tubo 
5. Metemos el tubo en la estufa a 37ºC durante 24 horas
6. Finalmente la prueba es negativa porque no hay cambio de color. Uno de los posibles errores puede ser que la placa tenía mucho tiempo y podía estar muy seca.

Resultado y lectura

- Prueba oxidasa: +

- Prueba de fermentación de azúcares: +, pero sin producción de gas 

- Prueba de ONPG: -