Práctica 10: Pruebas bioquímicas de identificación de bacilos gram negativos

Pruebas bioquímicas de identificación de bacilos gram negativos

Objetivo

El objetivo de la pruebas bioquímicas es ver si nuestro microorganismo es un bacilo gram negativo

Fundamento y significado clínico

 Para la identificación de los bacilos gram-negativos aerobios, del tipo de la enterobacterias, se realiza una batería de pruebas bioquímicas con la que se identifica a los que se aíslan más frecuentemente en nuestro medio. Estas pruebas incluyen: Kliger, IMVIC; que incluye la producción de INDOL, el rojo de metilo, voges-proskauer y el citrato, además otras pruebas como el test de la urea, fenil alanina desaminasa, reducción de nitrato y descaboxilación de lisisna, ornitina y arginina.

Materiales

• Mechero bunsen

• Asas de siembra e hilos estériles

• Portaobjetos

• Papel de filtro

Muestra 

• Proteus

• Pseudomonas

Reactivos

• Reactivo de kovacs

• Rojo de metilo

• VP1 y VP2

• Medios de cultivo de: Kliger, agua de peptona, rojo de metilo, citrato y urea

Aparataje

• Estufa 

Procedimiento

- Agar hierro kliger
Esta prueba permite identificar a las enterobacterias. El medio agar hierro de kliger es un medio sólido diferencial, que se prepara en un tubo inclinado y que contiene lactosa, glucosa, peptona y un indicador de pH (rojo fenol) que vira a amarillo cuando el pH es ácido y que toma un color más rojo intenso cuando el pH es alcalino. La fermentación se produce tanto en condiciones anaerobias (fondo del tubo) como aerobias (superficie del tubo), siguiendo varias rutas metabólicas. 

• Procedimiento

1. Se prepara el medio kliger en la gradilla
2. Tomamos una colonia de la muestra de Proteus y se siembra con el hilo de platino en picadura en el fondo del tubo y a continuación se siembra en estría sobre la superficie del tubo (también con el hilo)
3. Incubamos durante 24 horas a 37º C

- IMVIC

Es un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas para la identificación bacteriana: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato.

• Producción de INDOL

Se usa para identificar bacterias que producen la enzima triptonasa para degradar el triptófano en indol, amonio y ácido. La presencia de indol se visualiza con el reactivo de kovacs, que provoca la formación de un anillo de color rojo en el tubo. 

• Procedimiento

1. Se prepara un caldo de peptona o triptona y se envasa en tubos
2. Se inocula una colonia de la muestra de Proteus 
3. Se incuba a 37ºC durante 24 horas

• Rojo de metilo

Se usa para identificar a las Enterobacterias, que pueden metabolizar la glucosa en 2 fases:

- Metabolismo aerobio (respiración) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio.

- Metabolismo anaerobio (fermentación) que puede ser de 2 tipos dependiendo de los productos finales obtenidos, que pueden ser:

Rojo de metilo, con fermentación ácido-mixta y Voges Proskauer, con fermentación butilen glicólica.

• Procedimiento

1. Se preparan dos tubos con el medio líquido de Clark-Lubs
2. Se inoculan las colonias bacterianas de la muestra de Proteus en ambas
3. Se incuban durante 24 horas a 37ºC

• Citrato

Se usa para identificar a las enterobacterias. En esta prueba se determina la presencia de la enzima citrasa que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono, dando lugar a productos alcalinos. El citrato se produce típicamente en el ciclo de krebs, pero algunos organismos son capaces de usarlo como única fuente de carbono, cuando no hay carbohidratos fermentables en el medio.

• Procedimiento

1. Preparamos el medio citrato de Simmons, lo envasamos y lo dejamos enfriar en pico de flauta
2. Sembramos de la muestra de Proteus sobre la superficie inclinada
3. Incubamos a 24 horas a 37ºC

- Test de la urea

Se utiliza para diferenciar a los microorganimos capaces de hidrolizar la urea por la acción del enzima ureasa.

Este enzima al hidrolizar la urea origina amoniaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador (rojo fenol)

- Procedimiento

1. Preparar un caldo de urea indol o agar un indicador añadido, en este caso el rojo fenol. Este no se esteriliza.

2. Las bacterias de la muestra de Proteus se inoculan

3. Incubamos a 37º durante 24 horas

- Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas

- Procedimiento

1. Ponemos un trozo papel de filtro sobre un portaobjetos

2. Dispensamos una colonia de Pseudomonas en centro con un asa de siembra

3.Añadimos el reactivo de kovacs

Lectura y resultado
- Kliger
+/-/+/+, es decir glucosa +, gas -, lactosa + y SH2 +

- IMVIC
- Producción de indol
Añadimos 4 gotas del reactivo de kovacs y al ser menos denso que el caldo de peptona, se queda en la superficie formando un anillo. 
En nuestro caso, el anillo es de color amarillo, por lo tanto es negativo.

- Rojo de metilo 
En el primer tubo, añadimos varias gotas de rojo de metilo y en el segundo añadimos unas gotas de solución de alfa-naftol y añadimos también KOH.
En el primer tubo podemos ver que vira a color rojo, en cambio en el segundo se queda del mismo color.
El de color rojo es positivo y el de color anaranjado en negativo.

-Citrato
En nuestro tubo la reacción de citrato no vira de color y se queda negativa

- Test de la urea
Los dos tubos son negativos, ya que no se ha observado ningún cambio de color

-Oxidasa
Al ser una prueba inmediata el resultado se ve al cabo de varios segundos después de haber añadido el reactivo de kovacs. En nuestro caso, fue positiva al aparecer un color morado intenso.