Práctica 7: Pruebas bioquímicas para identificación de cocos gram +

Pruebas bioquímicas para la identificación de cocos gram +

Objetivo

Identificar el coco gram + y realizar todas las pruebas bioquímicas para poder saber a que género pertenece

Materiales

• Asas de siembra desechables 

• Mechero bunsen 

• Micropipeta automática

• Puntas desechables

• Pinzas de metal

• Portaobetos 

• Tapones

• Tubos de hemólisis de 3 mL

Muestra

• Streptococcus aureus 

• Suero 

Reactivos

• Parafina líquida

• Agua oxigenada 

• Novobiocina 

Aparataje 

• Estufa

Procedimiento
- Catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno, que se desprende en forma de burbujas.
De esta manera, las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares. 
Se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus y Micrococcus (catalasa +) del género Streptococcus.

1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
2. Cogemos la placa que contiene nuestro microorganismo y con un asa de siembra estéril cogemos una colonia 
3. Depositamos la colonia sobre el porta y añadimos una gota de H2O2 (agua oxigenada)
4. Nos salen burbujas, así que la reacción es positiva lo que significa que es el género Staphylococcus o Micrococcus.

- Óxido- Fermentación 

Estudia la capacidad de los microorganismos para oxidar y/o fermentar la glucosa produciendo ácido, que se detecta por la presencia de un indicador de pH (azul de bromotimol), que vira de color verde a amarillo.

Se encarga de diferenciar cocos gram + entre sí. 

1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril 
2. Con el asa de siembra cogemos una colonia de nuestra placa de microorganismos
3. Sembramos en picadura, en dos tubos que contienen el medio de Hugh Leifson (O/F) adicionado de un 1% de glucosa
4. A uno de los tubos le añadimos un dedo de parafina líquida estéril para conseguir anaerobiosis
5. Incubamos durante 24 horas en la estufa a unos 37ºC 

*Si el medio se queda de color verde, es negativo. 

*Si el medio vira de verde a amarillo, es positivo.

- Resultado

El resultado es negativo, pues ninguno vira a amarillo. 

Debería haber uno de color amarillo y el otro verde (+/-)

- Fermentación del manitol

Estudia la capacidad de los microorganismos para fermentar el manitol y crecer en presencia de una elevada concentración de NaCl (Medio de Chapman).

Cuando el microorganismo fermenta el manitol se producen metabolitos ácidos que cambian el pH del medio y el indicador (rojo fenol) vira a amarillo.

Diferencia S.aureus del resto de los estafilococos.

1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
2. Con el asa de siembra cogemos una colonia de nuestra placa
3. Sembramos en otra placa, que contiene TSA, por agotamiento de estrías. 
4. Incubamos durante 24 horas en estufa a unos 37ºC.

*Si es aureus, crece y come y además vira a amarillo

*Si no es aureus, crece pero no cambia de color

- Resultado

El microorganismo creció, pero no viró a amarillo, lo que no tiene sentido. 

Tendría que virar a amarillo, ya que es un aureus y debería virar a amarillo.

- DNAsa

Estudia la capacidad que tienen algunas bacterias para producir la enzima DNAsa,que produce la degradación del ADN que contiene el medio de cultivo. 

Diferencia las especies patógenas de Staphylococcus ( DNAsa +) de las no patógenas (DNAsa -).

1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
2. Con un asa de siembra estéril cogemos una colonia de nuestra placa que contiene el microorganimo
3. Sembramos en la placa que contiene agar DNAsa haciendo una estría de unos 2 cm
4. Incubamos durante 24 horas a unos 37ºC

- Resultado

Esta prueba también salió negativa, ya que no se coloreó el medio.

*Hacemos la lectura añadiendo HCl 1 N (que precipita el ADN), o azul de toluidina al 1%, y observando la aparición de zonas clara o coloreadas de rosa respectivamente, alrededor de la zona sembrada.

- Coagulasa

Estudia la capacidad del microorganismo para producir la enzima coagulasa que origina la coagulación del plasma humano o de conejo. 

Diferencia los S.aureus (coagulasa +) de los otros Staphylococcus (coagulasa -). 

1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
2. Añadimos 0,5 mL de suero a un tubo de 3 mL
3. Con el asa de siembra cogemos una colonia bastante grande y la añadimos en el tubo con el suero
4. Removemos 
5. Incubamos en la estufa durante 4 horas a 37ºC

- Resultado

*Si es negativo se reincuba durante toda la noche y se lee a las 18-24 horas.

*Si es positivo se observa un coágulo total o parcial

- Sensibilidad a la Novobiocina

Algunas especies del género Staphylococcus son resistentes a la novobiocina. 

Diferencia S.saprophyticus (resistentes a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos. 

1. Encendemos le mechero bunsen para crear un ambiente estéril 
2. Con el asa de siembra cogemos de la placa donde están los microorganismos
3. Sembramos en masa en un medio TSA
4. Con ayuda de unas pinzas, cogemos un disco de novobiocina y lo colocamos en medio de la placa (sin arrastrar)
5. Incubamos durante 24 horas a unos 37ºC

- Resultado

Es sensible a la novobiocina, ya que se puede apreciar un halo 

* A las 24 horas observamos la placa y podremos ver un halo de inhibición de 16 mm que corresponde a S.saprophyticus.

Un halo mayor a 16 mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos. 

La no aparición de halo de inhibición indica resistencia a la novobiocina.