Práctica 6: Tinciones estructurales

Tinciones estructurales

Objetivo
El objetivo de la práctica es realizar extensiones y añadirles colorantes para hacer el examen microscópico

Fundamento
El fundamento de la práctica es utilizar las distintas técnicas de extensión, fijación y tinción de microorganismos

Materiales
  • Portaobjetos

  • Asa de siembra
  • Mechero bunsen 
  • Antorchas (algodón graso en un mango)

  • Cubetas para la tinción


Muestra
  • Bacillus Subtitulis


Reactivos

  • Agua destilada

  • Colorante: Verde malaquita
  • Colorante: Safranina
  • Colorante: Cristal violeta

  • Solución de sulfato de cobre al 20%

  • Colorante: fucsina
  • Colorante: nigrosina al 1%

Aparataje
  • Microscopio
Procedimiento
- Extensión y tinción de esporas
  1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
  2. Flameamos el asa de siembra
  3. Cogemos el porta y con el asa de siembra cogemos agua destilada y la extendemos en el porta
  4. Flameamos el asa de siembra
  5. Cogemos Bacillus Subtitulus de la placa de petri y lo añadimos en el porta y lo homogeneizamos con el agua haciendo una extensión
  6. Dejamos secar al aire
  7. Fijamos con la llama azul del mechero
  8. Cubrimos la preparación con verde malaquita 1 minuto en frío
  9. Calentamos, con un hisopo del algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisión de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos. A partir de la emisión de vapores empezamos a contar los 5 minutos y añadimos el colorante.
  10. Quitamos el exceso de colorante y lavamos con agua
  11. Teñimos con safranina durante 1 minuto
  12. Lavamos con agua, dejamos secar y observamos al microscopio











- Extensión y tinción de cápsulas (método de anthony)
  1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
  2. Flameamos el asa de siembra
  3. Cogemos el porta y con el asa de siembra cogemos agua destilada y la extendemos en el porta
  4. Flameamos el asa de siembra
  5. Cogemos Bacillus Subtitulus  de la placa de petri y lo añadimos en el porta y lo homogeneizamos con el agua haciendo una extensión
  6. Dejamos secar al aire
  7. No lo fijamos con la llama del mechero
  8. Cubrimos la extensión con cristal violeta 1 minuto
  9. Lavamos con solución saturada de sulfato de cobre al 20% para aumentar la refringencia de la cápsula
  10. Secamos al aire
  11. Observamos al microscopio




- Extensión y tinción de cápsulas (tinción de burri o de la tinta china o tinción negativa)
  1. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente estéril
  2. Flameamos el asa de siembre
  3. Cogemos el porta y con el asa de siembra cogemos agua destilada y la extendemos en el porta
  4. Flameamos el asa de siembra
  5. Cogemos Bacillus subtitulus  de la placa de petri y lo añadimos en el porta y lo homogeneizamos con el agua realizando una extensión
  6. Dejamos secar al aire 
  7. No fijamos con la llama del mechero 
  8. Cubrimos la extensión con fucsina diluida durante 2 minutos
  9. Lavamos con agua destilada
  10. Secar al aire
  11. Añadimos 2-3 gotas de nigrosina al 1% en un extremo del porta con el frotis y extendemos por el método de la cuña (dos portaobjetos)
  12. Secamos y observamos al microscopio


Resultados
- Tinción de esporas: Esporas de color verde y células vegetativas de color rojo
- Tinción de cápsulas: Las cápsulas se observan como un halo transparente ligeramente azulado alrededor de la bacteria que se tiñe de violeta
- Tinción de cápsulas (china): Sobre un fondo negro se observan los MO teñidos de color rojo y la cápsula como un halo blanco que los rodea

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