Práctica 5: Tinción de gram

TINCIÓN DE GRAM

Objetivo 
El objetivo de la práctica es diferenciar las bacterias gram + y las gram - en función de la distinta composición de su pared bateriana

Fundamento 
La tinción de gram para teñir bacterias la desarrolló el bateriólogo Hans Christian Joachin Gram en el año 1884. Las baterias gram + se tiñen de color rojo y las gram - de color azul. 
Para que la tinción se pueda visualizar al microscopio la preparación de la misma debe ser fina. 
Para visualizar la preparación utilizaremos el objetivo de 10x para hacer un barrido y después el objetivo de 100x con aceite de inmersión (ya que las bacterias se ven con el objetivo de 100x).

Materiales
  • Mechero bunsen 

  • Portaobjetos
  • Asa de siembra 
  • Pinzas de madera

  • Cubeta para tinción y paralelas 


Aparataje
  • Microscopio


Reactivos
  • Agua destilada 
  • Colorantes (cristal violeta, lugol, acetona-alcohol y safranina)

Muestra
  • Placa de petri con Serratia
  • Tubo de ensayo con Bacillus

Procedimiento 
- Extensión, desecación y fijación
  1. Encendemos el mechero bunsen, para crear una zona estéril donde poder trabajar 
  2. Flameamos el asa de siembra y enfriamos, cogemos agua destilada y la colocamos en el porta.
  3. Flameamos de nuevo el asa 
  4. Abrimos la placa que contiene el microorganismo, en nuestro caso la Serratia, y cuando el asa este fría cogemos el microorganismo y lo depositamos en el porta. Cuando tengamos el microorganismo, cerramos la tapa de la placa.
  5. Al tener el microorganismo en el porta, homogeneizamos y mezclamos con la gota de agua destilada para realizar una suspensión. 
  6. Dejamos secar la preparación al aire 
  7. Cuando la muestra esté seca, la fijamos utilizando calor. Esto lo conseguimos pasando el porta, tres veces, por la llama azul del mechero. Debemos tener cuidado de no calentar mucho el porta. 
Cuando hayamos hecho el porta con el microorganismo de la placa, realizaremos otro porta con una muestra en tubo. 
  1. Realizamos los mismos pasos que para hacer la extensión con la placa. Flameamos el asa, enfriamos, cogemos el agua, la depositamos en el porta, flameamos de nuevo.
  2. A continuación abrimos el tubo, y flameamos la boca del tubo, cogemos muestra con ayuda de el asa y cuando terminemos, volvemos a flamear la boca del tubo y cerramos.
  3. Homogeneizamos la muestra y la extendemos en el porta. 
  4. Dejamos secar
  5. Fijamos con calor






- Tinción
Las extensiones ya fijadas, se colocan en unas paralelas que estarán sobre una cubeta de tinción. 
Necesitamos 4 tipos de colorantes: crital violeta, lugol, decolorante y safrinina.
  1. Cubrimos la preparación con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto
  2. Lavamos con agua destilada ligeramente
  3. Cubrimos con lugol (mordiente que acentúa la penetración del colorante primario) durante 1 minuto
  4. Lavamos con agua destilada ligeramente
  5. Decoloramos con alcohol-acetona durante 15-20 segundos. Este colorante solo se encarga de arrastrar el colorante en las bacterias gram - . *Esta es la parte más complicada de al tinción de gram, ya que si se pasa de tiempo se pueden obtener resultados erróneos. 
  6. Lavamos con abundante agua, para que no quede nada de alcohol 
  7. Cubrimos con el colorante de contraste, la safranina, durante 1 minuto y 30 segundos. Este colorante se encarga de teñir de rojo las bacterias decoloradas, es decir, las gram - que tienen una pared celular fina. 
  8. Lavamos con agua destilada
  9. Dejamos secar 
  10. Observamos al microscopio













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